Detección de microorganismos patógenos mediante dispersión de luz heterodina
En este estudio, realizamos una caracterización morfológica de poblaciones bacterianas en suspensiones acuosas utilizando dos técnicas de dispersión de luz: Heterodina de Campo Cercano y Dispersión Dinámica Tridimensional. Se generaron perfiles de dispersión para cada cepa en un amplio rango del vector de dispersión.
OBJETIVOS:
• Obtener observables físicos del análisis de los resultados de simulaciones numéricas y de las señales de dispersión de luz provenientes de diferentes microorganismos móviles.
• Entender la dinámica coloidal de microorganismos activos en suspensión y su relación con la patogenicidad de estos mediante el uso de simulaciones numéricas en computadora y experimentos ópticos.
• Proponer modelos físicos que describan los observables asociados con la dinámica de los distintos microorganismos en suspensión.
Las propiedades dinámicas de Escherichia coli en suspensión han sido ampliamente estudiadas experimentalmente debido a su prevalencia en agua potable y a todas sus afecciones gastrointestinales e infecciones en el tracto urinario que pueden ser mortales en organismos inmunocomprometidos. El primer estudio del movimiento bacteriano fue realizado por Nossal, Chen y Lai en 1971 utilizando dispersion dinámica de luz, siendo ellos capaces de medir la distribución de velocidades de la bacteria Escherichia coli K12. En general, el movimiento de las bacterias es debido a la propulsión flagelar, i.e., la bacteria se desplaza por apéndices móviles o flagelos formados por un motor reversible, codo y filamento. Escherichia coli posee flagelos con una longitud de 6 a 10 μm, los cuales se mueven a una velocidad de 200-1000 rpm, los flagelos se agrupan y rotan en sentido antihorario propulsando a la bacteria para un nado en línea recta por un período de 1 s. Después, los flagelos se desagrupan provocando que la bacteria entre en un estado de agitación durante un intervalo de tiempo de 0.1 s, para posteriormente regresar al estado de nado en línea recta. Este último se considera un movimiento balístico a velocidad constante con una dirección elegida aleatoriamente.
Los experimentos realizados de microorganismos en suspensiones acuosas diluidas en nuestro laboratorio fueron con las siguientes cepas: Escherichia coli enterohemorrágica que infecta humanos (EHEC FN253), Escherichia coli enteropatógena que infecta conejos (EPEC E22wt) y su mutante isogénica que no expresa flagelo (EPEC E22ΔfliC), Salmonella typhimurium (S. typhi), Citrobacter werkmanii (C.werkmanii), Aeromona hydrophila (A. hydrophila) y Pseudomona aeruginosa (P. aeruginosa). Contamos con caracterizaciones morfológicas cualitativas de todos los sistemas tales como: Cinética de crecimiento, Ensayos de Motilidad, Cultivos en cajas de Petri y Microscopia óptica. La caracterización morfológica de los microrganismos nos permitió definir los parámetros requeridos en el esquema de simulación numérica.
Las cepas bacterianas fueron visualizadas mediante tinción con azul de metileno utilizando un microscopio Leica DM 4500B (Leica Microsystems, Alemania) a un aumento de 100X. Las imágenes fueron capturadas con una cámara Lumenera INFINITY 1C USB 2.0. Para cada cepa, se tomaron nueve imágenes en regiones donde las bacterias estaban bien separadas y distribuidas uniformemente. De cada imagen, se realizaron 50 mediciones de la longitud y el ancho de las bacterias, lo que permitió calcular las dimensiones promedio y sus respectivas desviaciones estándar para cada cepa. Finalmente se realizó un aumento digital al 400% para observar la geometría esferocilíndrica.